ВОЗМОЖНОСТИ ПРОЛОНГАЦИИ ДОПУСТИМЫХ СРОКОВ ИШЕМИИ ПОЧКИ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РАЗНЫХ ВАРИАНТОВ ПРОТИВОИШЕМИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ

В.И. Кирпатовский, О.Н. Надточий, Е.В. Сыромятникова

НИИ урологии МЗ РФ (директор - академик РАМН Н.А.Лопаткин)

 

Проблема интраоперационной защиты почек от ишемического повреждения при урологических операциях, связанных с временным выключением почки из кровообращения, по-прежнему остается актуальным объектом исследований в связи с малой прогнозируемостью характера восстановления функции оперированного органа, особенно у больных с осложненной ситуацией (единственная почка, билатеральное поражение с существенным снижением функции контрлатерального органа, предположительно длительный период прекращения кровоснабжения почки и др.). Развитие почечной недостаточности в таких случаях значительно утяжеляет течение послеоперационного периода и повышает риск развития опасных для жизни осложнений. Надежная защита почки от ишемического повреждения  в этих ситуациях может уменьшить  потенциальные опасности подобных операций.

Особенно важна противоишемическая защита при аутотрансплантации почки, когда срок ишемии органа наиболее продолжителен. В этих случаях необходимо применять весь имеющийся комплекс противоишемических мероприятий.

В настоящее время имеется 3 основных пути уменьшения постишемических функциональных расстройств: 1. Снижение температуры органа для ингибирования его метаболизма и уменьшения потребности в кислороде; 2. Использование защитных консервирующих растворов для замены им крови в сосудистом русле органа и химико-фармакологических воздействий на клетки; 3. Медикаментозное воздействие на метаболизм органа до и/или после периода ишемии.

В литературе имеются многочисленные данные, свидетельствующие о том, что комбинированная противоишемическая защита почки является наиболее эффективным средством предупреждения постишемических функциональных расстройств [2, 3, 11, 12, 13, 18]. При этом авторы, как правило, проводили сравнительные исследования разных вариантов при стандартной длительности ишемического периода, сравнивая выраженность развивающихся функциональных нарушений и интерпретируя результаты с точки зрения трансплантации органов. Однако, вопрос, насколько тот или иной вид защиты или их комбинация позволит увеличить допустимое время выключения почки из кровобращения in situ во время проведения операции на этом органе  остается малоисследованным. Для того, чтобы ответить на этот вопрос, мы провели специальные эксперименты, в которых почки, защищенные разными методами, исследовались через разные сроки ишемии.

 

Материал и методы исследования.

Эксперименты были проведены на 94 белых беспородных крыах массой 290-370 г. В условиях пережатия почечных сосудов разной длительности изучали защитный эффект локального охлаждения почки до 16-18 ^ОС или 4 ^ОС, промывания ее сосудистого русла консервирующим раствором и использования фармакологических противоишемических средств - a-токоферола и верапамила (изоптина). Выраженность ишемического повреждения почек оценивали в условиях, имитирующих восстановление кровотока в органе. Для этого почки, перенесшие тот или иной период ишемии удаляли вместе с аортой и нижней полой веной и перфузировали через аорту в течение 5 минут теплым оксигенированным физиологическим раствором. После этого собирали оттекающий от почки перфузат (за 1 минуту), в котором определяли активность внутриклеточного фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ) с помощью набора реактивов фирмы “Лахема”, и удаляли корковое вещество почек, в котором определяли содержание конечного продукта перекисного окисления мембранных липидов - малонового диальдегида (МДА) в реакции с тиобарбитуровой кислотой  [9]. Поскольку именно состояние клеточных мембран определяет обратимость повреждения клеток и дальнейшую судьбу ишемизированного органа, мы считали, что эти показатели, характеризующие выраженность деструктивных процессов в липидном слое мембран (концентрация МДА в ткани почки) и сохранность их барьерной функции (выход ЛДГ из почки в перфузат) могут служить объективными ориентирами состояния ишемизированной почки.

Были проведены следующие серии опытов:

1 серия - пережатие почечных сосудов на 1 час без каких-либо методов противоишемической защиты (негативный контроль).

2 серия - пережатие почечных сосудов при наружном охлаждении почки до 16-18 ^ОС, что достигалось обкладыванием органа салфетками, пропитанными холодным (4^ОС) физиологическим раствором.

3 серия -  то же, но крысам предварительно вводили внутрибрюшинно масляный раствор a-токоферола за 24 и 3 часа до опыта в дозе 50 мг/кг и изоптин за 30-40 минут до опыта в дозе 2,5 мг/кг. По нашим данным и данным других авторов эти препараты оказывают выраженное защитное действие при тепловой ишемии почки [1, 4, 7, 14, 19, 20].

4 серия - пережатие почечных сосудов с охлаждением почки до 16-18 ^ОС с добавлением в оксигенированный физиологический раствор, которым реперфузировали почки после ишемии, эмульсии a-токоферола в дозе 10 мг/л и изоптина в дозе 5 мг/л. О методике приготовления эмульсии a-токоферола и ее антиоксидантных и противоишемических свойствах сообщалось в работах [7, 8].

5 серия - пережатие почечных сосудов с промыванием почки консервирующим раствором Евроколлинз и охлаждением до 16-18 ^ОС. Для этого в брюшную аорту ниже почечных сосудов вводили тонкий катетер, пережимали аорту выше почек и сосуды контрлатеральной почки и через катетер вводили 2-3 мл холодного консервирующего раствора, после чего пережимали сосудистую ножку и снимали зажим с аорты и контрлатеральной почечной ножки, а ишемизированную почку дополнительно орошали холодным физиологическим раствором.

6 серия - пережатие почечный сосудов с охлаждением почки до 4 ^ОС, что достигалось обкладыванием органа мелко наколотым тающим льдом.

7 серия - то же самое, но после ишемии почки реперфузировали физиологическим раствором с добавлением эмульсии a-токоферола и изоптина.

8 серия - промывание почки раствором Евроколлинз и ишемия при 4 ^ОС. В этой и последующей сериях при длительных сроках ишемии (более 3 часов) почки после промывания и полного охлаждения удаляли блоком с аортой и нижней полой веной и хранили ex vivo при 4 ^ОС, имитируя условия экстракорпорального хранения при аутотрансплантации и аллотрансплантации почки.

9 серия - как в 8 серии, но в реперфузионный физиологический раствор добавляли эмульсию a-токоферола и изоптина.

10 серия - промывание почки раствором Евроколлинз с добавлением в него эмульсии a-токоферола и изоптина с последующим экстракорпоральным хранением при 4 ^ОС.

Сроки ишемии в разных сериях опытов колебались от 1 до 24 часов и выбирались в зависимости от эффективности того или иного вида противоишемической защиты. Количество экспериментов при каждом сроке ишемии колебалось от 3 до 6 в зависимости  от динамики и разброса результатов исследования.

 

Результаты и их обсуждение.

Согласно полученным данным (табл. 1 и 2), если после тепловой ишемии почки в течение 1 часа оба изучаемых показателя (выход ЛДГ из почки в перфузат  и тканевая концентрация МДА) достоверно возрастали, указывая на выраженное повреждение почки, то охлаждение почки до 16-18 ^ОС или 4 ^ОС отодвигало время наступления таких изменений ко 2-му часу. При этом достоверных различий между опытами с охлаждением до 16-18 ^ОС и охлаждением до 4 ^ОС получено не было. Это находится в соответствии с ранее опубликованными данными, что в условиях более глубокого охлаждения органа в большей степени начинают проявляться негативные эффекты гипотермии в отношении структуры и функции  клеточных мембран, которые нивелируют позитивный эффект охлаждения, проявляющийся в торможении метаболизма органа и снижении потребности в кислороде [6].

Предварительное введение фармакологических препаратов (a-токоферола с изоптином) или их добавление в реперфузионный раствор (что имитировали введение препаратов реципиенту перед реперфузией почки) добавляло к допустимому сроку ишемии еще 1 час при охлаждении до 16-18 ^ОС. При этом достоверных различий между 2 вариантами фармакологического воздействия не обнаружено. При охлаждении почки до 4 ^ОС добавлением противоишемических препаратов в перфузионный раствор увеличивало допустимое время ишемии на 2 часа. То есть, комбинация фармакологического воздействия с глубоким охлаждением оказалась более эффективной, чем ее комбинация с умеренным охлаждением.

Такой эффект можно объяснить следующим образом. При снижении температуры клеток ниже определенного предела (для большинства клеток ниже 14-16 ^ОС) происходит изменение физического состояния определенной части фосфолипидов, входящих в состав клеточных мембран с их переходом из жидкокристаллического состояния  в гелевое. В результате этого оставшиеся неотвердевшими липиды, представляющие собой легко окисляющиеся соединения с большим количеством двойных связей в молекулах жирных кислот, концентрируются в определенных участках мембран (доменах) и становятся чрезвычайно подвержены переокислению, а затем расщеплению и элиминации, в результате чего барьерные свойства мембран резко нарушаютя. В этих условиях a-токоферол, являясь мощным антиоксидантом, встраиваясь в липидный слой, препятствует этой активации перекисного окисления липидов и сохраняет барьерные свойства клеточных мембран. То есть, помимо противоишемического действия, a-токоферол в условиях сниженной температуры оказывает и криозащитное действие, ослабляя негативные последствия глубокого охлаждения, и  более надежно защищая клетки. Кроме того, в состав эмульсии a-токоферола входит в качестве ингридиента диметилсульфоксид, который ткже обладает криозащитным, противоишемическим и антиоксидантным действием [5, 10], что может оказывать дополнительный защитный эффект.

 Промывание консервирующим раствором и хранение при 4 ^ОС позволяло сохранить почки в течение 3 часов, а к 6 часам уже отмечалось возрастание выхода ЛДГ из почки в перфузат, хотя активность ПОЛ достоверно не отличалась от аналогичных опытов без использования консерванта. В то же время, использование раствора Коллинза в комбинации с умеренным охлаждением почки (до 16-18 ^ОС) практически не повысила противоишемическую резистентность органа. Таким образом, консервирующий раствор оказывает защитное действие лишь в условиях максимального подавления клеточного метаболизма глубоким охлаждением.

По данным литературы это может быть связано с тем, что гиперкалиевые консервирующие растворы, к которым относится раствор Евроколлинз, за счет выравнивания калий-натриевого градиента через клеточную мембрану и снижения трансмембранного потенциала клеток активизируют  транспорт ионов через цитоплазматическую мембрану. Для восстановления нарушенного электролитного гомеостаза, что ведет к усилению расходования АТФ и истощения его резервов в условиях ишемии, а также более быстрому закислению внутриклеточной среды за счет усиления образования АТФ в реакциях гликолиза [6, 15-17]. Эти процессы могут негативно влиять на состояние клеточного метаболизма в условиях ишемии и нивелировать  позитивное действие консервирующих растворов, связанное с быстрым охлаждением, уменьшением отека клеток и лучшей сохранностью сосудистого русла. Подавление клеточного метаболизма низкой температурой блокирует активный транспорт ионов и связанный с этим расход АТФ и позволяет реализоваться в полной мере всем позитивным действиям консерванта.

Наиболее длительная сохранность почки получена в опытах с консервацией почки при 4 ^ОС и добавлением фармакологических препаратов в консервирующий раствор или в раствор, которым  реперфузировали орган. В этих экспериментах даже после 24 часов хранения оба показателя хотя и  возрастали по сравнению с нормой, но в меньшей степени, чем в других сериях экспериментов.

Таким образом, комбинированная защита почки, включающая в себя все 3 противоишемических компонента (охлаждение, консервирующий раствор и противоишемические средства) обладает наибольшей эффективностью и позволяет сохранять орган вне организма до 24 часов, что вполне достаточно для  проведения как аутотрансплантации, так и аллотрансплантации. Суммация положительных эффектов каждого из компонентов противоишемической защиты обусловлена тем, что они обладают разным механизмом действия и реализуют свой эффект путем воздействия на разные звенья патогенеза ишемического повреждения. Охлаждение почки за счет снижения интенсивности обменных процессов действует на самые начальные звенья патогенеза. Консервирующий раствор препятствует избыточному вхождению натрия в клетку во время ишемии, что способствует поддержанию трансмембранного потенциала, сохранению внутриклеточного содержимого и уменьшению отека. Кроме того, сохранение трансмембранного потенциала стабилизирует структуру мембран и сохраняет связи между белковыми и липидным слоями мембраны. a-токоферол повышает антиоксидантный резерв клеток и тормозит активацию перекисного окисления мембранных липидов, тогда как изоптин препятствует избыточному поступлению кальция из внеклеточного пространства в клетку и таким образом предупреждает избыточную активацию Са²⁺-зависимой фосфолипазы А₂, расщепляющей мембранные фосфолипиды.