Вестник реабилитации органов
и тканей
№ 1, 2004 год
|
Экспериментальное исследование |
ИЗМЕНЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ МЕТАБОЛИЗМА И ФУНКЦИИ ПОЧЕК ИНТАКТНЫХ КРЫС ПОСЛЕ ПАРЕНТЕРАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ ГИПОХЛОРИТА НАТРИЯ
В.И. Кирпатовский, А.П. Данилков, В.В. Иващенко, С.А. Салманов, Ю.В. Кудрявцев, С.А. Голованов,
В.В Дрожжева , Л.А. Михеева, Т.А. Бойко, Е.В. Сыромятникова
НИИ урологии ( дир.-акад. РАМН Н.А. Лопаткин ) Минздрава РФ, Москва
В экспериментальных работах на крысах мы выявили повышение структурно-функциональной толерантности почек к ишемии при парэнтеральном введении 0,06 % раствора гипохлорита натрия (ГН) в предишемическом периоде. Снижалась выраженность альтерации эпителиоцитов почечных канальцев и ускорялось развитие репаративной фазы воспалительной реакции. Выживаемость крыс на 7 сутки постишемического периода в исследуемой группе составила 80 %. В контрольной группе животных, которым в предишемическом периоде внутрибрюшинно вводили физиологический раствор, выживаемость составила 33 %. Полученные результаты оказались сравнимыми с результатами противоишемической защиты органов препаратами с мембранотропным действием: преднизолон, лидокаин, a-токоферол [4]. Реализация механизма их защитного действия включает в себя неспецифический компонент, заключающийся в индукции энергетического дефицита в клетках, модификации клеточных мембранных структур и ферментных комплексов, активациии резервных путей образования энергии, в первую очередь гликолиза, а также в стимуляциии синтетических процессов, лежащих в основе обновления клеточных структур [5,10].
В связи с этим, целью данного исследования явилось выяснение вопроса, связано ли повышение толерантности почки к ишемическому воздействию под влиянием ГН с аналогичным механизмом действия, как у вышеназванных мембранотропных препаратов, и в какой зависимости находятся метаболические показатели и функциональные способности почек от концентрации введенного парэнтерально раствора ГН.
Материалы и методы.
Экспериментальную работу выполнили на 15 белых беспородных крысах массой 150-250 грамм. Контрольную группу № 1 составили 5 крыс, их не подвергали никаким воздействиям. Экспериментальная группа № 2 состояла из 5 крыс, им в течение 4 дней в/б вводили 1 мл 0,02 % раствора ГН. В исследуемую группу № 3 вошли также 5 крыс, им в течение 4 дней в/б вводили 1 мл 0,06 % раствора ГН. Указанные концентрации ГН были выбраны в связи с тем, что для концентрации 0,06 % мы доказали наличие достоверного противоишемического эффекта, однако в этой концентрации препарат можно вводить только в центральную вену с высокой скоростью кровотока из-за опасности химического повреждения сосудистой стенки. Концентрация 0,02 % обладает значительно менее выраженным повреждающим эффектом, и в этой концентрации ГН можно вводить в периферическую венозную систему.
Животных всех исследуемых групп выводили из эксперимента на 5 сутки наблюдения. Крыс помещали в обменные клетки, собирали мочу в течение 24 часов. Измеряли массу животного. В условиях тиопенталового наркоза брали кровь пункционно из нижней полой вены, а также удаляли почки и готовили из их коркового слоя гомогенат для последующих исследований. Крыс забивали избыточной дозой тиопентала натрия.
Биохимические исследования крови и мочи (мочевина, креатинин, калий, натрий, осмолярность) проводили на аппарате «ФП-901М» с помощью стандартных наборов реактивов. Из этих данных рассчитывали клиренс креатинина и экскретируемую фракцию отфильтрованного натрия (EFNa). Кроме того, в моче исследовали активность ферментов, локализованных преимущественно в щеточной кайме эпителиальных клеток извитых канальцев: нейтральная-a-гликозидаза (н-АГЗ), g-глутамилтрансфераза (ГГТ), щелочная фосфотаза (ЩФ), - и ферментов цитозоля клеток - аспартатаминотрансфераза (АСТ), аланинаминотрансфераза (АЛТ), лактатдегидрогеназа (ЛДГ) [2,6,9].
Для оценки активности процессов перекисного окисления мембранных фосфолипидов (ПОЛ) определяли уровень продуктов распада гидроперекисей по содержанию малонового диальдегида (МДА) и диеновых конъюгатов (ДК) в плазме крови, содержащей 0,2 % натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), моче и гомогенате почечной ткани [3]. Гомогенат коркового вещества почки готовили на фосфатном буфере (рН=5,9) с добавлением ЭДТА из рассчета 10 мг ткани на 1 мл буфера. Показатели ПОЛ определяли в супернатанте
Для определения тканевого содержания адениннуклеотидов и молочной кислоты готовили гомогенат коркового вещества почки на фосфатном буфере с рН 5,9 в соотношении 1:10, после чего добавляли равное количество 0,6н перхлорной кислоты. Пробы центрифугировали и в супернатанте определяли концентрацию аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), аденозиндифосфорной кислоты (АДФ), аденозинмонофосфорной кислоты (АМФ) и лактата методом жидкостной хроматографии.
Раствор ГН готовили на аппарате «ЭДО-4» на основе стерильного физиологического раствора в электрохимической камере. Концентрацию полученного раствора определяли методом оксидометрического титрования согласно материалам технической документации.
Статистическую обработку данных производили на персональном компьютере в программе «Statistica 5,0» с расчетом достоверности по непараметрическому U- критерию Манна-Уитни.
Результаты исследования и их обсуждение
Поскольку ГН (NaClO-), попадая в биологическую среду (кровь, лимфа), моделирует функцию микросомального окисления цитохрома Р450, то есть монооксигеназный путь окисления с образованием активных форм кислорода, таких как супероксидный анион радикал, перекись водорода, гидроксильный радикал, которые инициируют реакции свободнорадикального окисления [1, 8], мы провели определение влияния парэнтерального введения ГН на активность ПОЛ в крови, моче и ткани почки (таблица 1).
Таблица 1. Содержание МДА и ДК в крови, моче и гомогенате почечной ткани крыс (М±m).
Показатели |
Группа 1 (контр.) |
Группа 2 |
Группа 3 |
МДА гомогената, мкмоль/л |
16,5 ± 0,8 |
15,2 ± 0,3 |
17,2 ± 0,5 2 |
ДК гомогената, мкмоль/л |
5,2 ± 1,4 |
7,8 ± 1,7 |
7,5 ± 2,6 |
МДА крови, мкмоль/л |
2,58 ± 0,24 |
2,65 ± 0,91 |
2,84 ± 0,19 |
ДК крови, мкмоль/л |
4,6 ± 0,7 |
4,7 ± 0,3 |
2,65 ± 0,2 1, 2 |
МДА мочи, мкмоль/л |
11,5 ± 2,0 |
11,7 ± 1,8 |
27,6 ± 6,5 |
ДК мочи, мкмоль/л |
0,6 ± 0,1 |
1,0 ± 0,2 |
2,6 ± 1,6 |
МДА мочи/ креат. мочи |
6,1 ± 1,1 |
7,0 ± 1,4 |
5,6 ± 1,8 |
ДК мочи/ креат. мочи |
0,4 ± 0,1 |
0,4 ± 0,1 |
1,0 ± 0,5 |
Примечание: 1 - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с данными группы 1 (контрольная);
2 - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с данными группы 2
При этом мы обнаружили, что концентрация МДА в ткани почки в 3 группе достоверно превышала аналогичные данные во 2 группе. Тканевая концентрация ДК во 2 и 3 группах была на 50% больше средних значений, полученных в 1 группе, но эта разница оказалась статистически недостоверной в связи с большим разбросом величины этого показателя в группах. В крови показатели активности ПОЛ существенно не менялись, за исключением снижения концентрации ДК в 3 группе. Содержание МДА в моче в пересчете на 1 ммоль креатинина мочи в исследуемых группах по сравнению с данными в контрольной группе различалось незначительно, а содержание ДК мочи в аналогичном пересчете в 3 группе в 2,5 раза превышало средние показатели в группах 1 и 2, однако статистически значимой достоверности эта разница не достигла.
В целом можно утверждать, что в результате воздействия 0,02 % и 0,06 % растворов ГН в ткани почки происходит активация процессов ПОЛ, однако при использовании концентрации 0,02 % эта активация менее выражена и происходит не у всех животных. При этом в крови содержание продуктов распада гидроперекисей фосфолипидов не увеличивалось, а концентрация ДК крови в группе 3 даже снижалась, что, по нашему мнению, свидетельствует об эффективной работе антиоксидантной системы крови. По-видимому, происходит увеличение мощности естественного антиоксидантного статуса организма (антиоксидантных систем) под влиянием усиленного образования свободных радикалов [7]. В моче показатели активности ПОЛ также существенно не изменялись за исключением возрастания ДК у ряда животных после введения 0,06 % раствора ГН.
Одним из прямых следствий активации ПОЛ в клетках является повышение проницаемости клеточных мембран в результате образования гидрофильных каналов в липидном бислое под действием гидроперекисей фосфолипидов и изменение внутримембранных белково-липидных взаимодействий. Через эти каналы усиливается поток ионов, молекул, вплоть до макромолекул по градиенту концентрации. Это может вести к усиленному выходу в мочу внутриклеточных ферментов. Кроме того, в результате мембранотропного действия свободных радикалов может повреждаться самый чувствительный участок нефрона - щеточная каемка эпителия проксимальных извитых канальцев, что сопровождается повышением активности в моче связанных с нею ферментов. Мы изучили изменение активности некоторых мембраносвязанных и цитозольных ферментов эпителиальных клеток извитых канальцев нефронов в моче после парентерального введения ГН (таблица 2).
Таблица 2. Активность ферментов мочи крыс в контрольной группе и в исследуемых группах после введения ГН (M±m).
ЕД / л х ммоль креатинина мочи |
Группа 1 (контрольная) |
Группа 2 |
Группа 3 |
н-АГЗ мочи |
1,0 ± 0,1 |
1,0 ± 0,2 |
0,5 ± 0,21 |
ГГТ мочи |
5,5 ± 1,6 |
3,2 ± 0,9 |
1,6 ± 0,51 |
ЩФ мочи |
13,2 ± 6,9 |
1,8 ± 0,6 |
0,7 ± 0,41 |
АЛТ мочи |
0,4 ± 0,2 |
1,7 ± 0,6 |
0,16 ± 0,12 |
АСТ мочи |
0,52 ± 0,3 |
0,8 ± 0,4 |
0,3 ± 0,1 |
ЛДГ мочи |
1,5 ± 0,4 |
1,7 ± 0,2 |
1,0 ± 0,4 |
Примечание: 1 - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с данными группы 1 (контрольная);
2 - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с данными группы 2
При анализе полученных результатов обращает на себя внимание, что в исследуемых группах активность мембраносвязанных ферментов щеточной каймы эпителиальных клеток извитых канальцев нефронов (н-АГЗ, ГГТ, ЩФ) снижается, причем в 3 группе - статистически достоверно (p<0.05). Активность цитозольных трансаминаз (АЛТ, АСТ) во 2 группе в среднем повышалась, однако из-за большого разброса данных разница не достигала статистически достоверной значимости, тогда как активность ЛДГ практически не менялась. В 3 группе активность всех 3 цитозольных ферментов снижалась, причем для АЛТ - статистически достоверно.
Таким образом, при 4-дневном введении 0,06 % раствора ГН интактным крысам, несмотря на активацию ПОЛ в почечной ткани, ферментурия не возрастает. Наоборот, отмечается снижение активности в моче всех исследованных ферментов щеточной каемки (н-АГЗ, ГГТ, ЩФ) и одного из цитозольных ферментов (АЛТ) при тенденции к снижению остальных цитозольных ферментов (АСТ, ЛДГ). С одной стороны, этот эффект можно объяснить стабилизацией клеточных мембран канальцевого эпителия, что уменьшает поступление внутриклеточных ферментов в мочу, но нельзя исключить и прямого влияния ГН, или индуцируемых им свободных радикалов кислорода, на каталитическую активность исследуемых энзимов. На мысль о возможности такого действия ГН наводят данные, полученные в группе 2 с введением 0,02 % раствора ГН. В этой группе отмечена тенденция к снижению активности мембраносвязанных ферментов (ГГТ и ЩФ) при повышении активности цитоплазматических ферментов (АЛТ, АСТ). Видимо, возможно сочетание эффекта стабилизации цитоплазматической мембраны и опосредованного этим изменения активности мембраносвязанных ферментов с прямым действием ГН на каталитическую активность ферментов.
Одним из основных показателей, характеризующих адекватность клеточного метаболизма, является состояние энергопродуцирующих систем клетки, индикатором работы которых служит содержание адениннуклеотидов и молочной кислоты в ткани органа. Тканевое содержание АТФ и других макроэргических соединений характеризует баланс между энергообразованием и энергорасходом в клетках, а концентрация лактата указывает на вклад в энергопродукцию гликолиза - резервного пути образования АТФ. Оказалось, что после 4-дневного парентерального введения ГН показатели энергообеспеченности клеток почки существенно меняются (таблица 3).
Таблица 3. Показатели состояния энергетического метаболизма в ткани почек крыс после введения ГН (М±m)
Показатели |
Группа 1 (контрольная) |
Группа 2 |
Группа 3 |
АТФ, мкмоль/грамм |
2,66 ± 0,08 |
2,35 ± 0,071 |
2,2 ± 0,081 |
АДФ, мкмоль/грамм |
0,86 ± 0,06 |
0,86 ± 0,05 |
0,89 ± 0,06 |
АМФ, мкмоль/грамм |
1,0 ± 0,02 |
0,98 ± 0,03 |
1,05 ± 0,04 |
Лактат, мкмоль/грамм |
81,8 ± 2,9 |
89,0 ± 2,7 |
97,0 ± 3,31 |
Примечание: 1- различия достоверны (р<0.05) по сравнению с данными группы 1 (контрольная)
Тканевая концентрация АТФ во 2 и 3 группах достоверно снижалась (p<0.05) по сравнению с данными в контрольной группе, причем наиболее выраженным это снижение было в 3 группе, в которой использовалась наибольшая концентрация ГН. Концентрации АДФ и АМФ изменялись недостоверно с тенденцией к возрастанию в 3 группе. В то же время концентрация в почечной ткани лактата увеличивалась пропорционально увеличению концентрации ГН, вводимого животным парэнтерально. Имелось достоверное различие между величинами показателей лактата в 3 группе по сравнению с контрольной группой.
Таким образом, парэнтеральное введение раствора ГН интактным животным приводило к развитию энергодефицитного состояния в клетках почки, проявляющемуся в снижении концентрации АТФ и возрастанию тканевого содержания молочной косилоты. Снижение концентрации АТФ, по-видимому, связано с его усиленной деградацией до АДФ и АМФ, свидетельством чего является рост содержания этих метаболитов в 3 группе. Увеличение концентрации лактата в исследуемых группах свидетельствует об активации анаэробных процессов синтеза АТФ - гликолиза, являющегося резервным путем дополнительного образования АТФ при недостаточной мощности аэробного пути его образования.
Поскольку были выявлены данные, свидетельствующие об активации ПОЛ и развитии энергодефицитного состояния в почке после курса терапии ГН, мы считали необходимым изучить влияние этого препарата на функциональное состояние интактных почек. Полученные результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4. Показатели функционального состояния почек интактных крыс после парентерального введения ГН (М±m)
Показатели |
Группа 1 (контрольная) |
Группа 2 |
Группа 3 |
Диурез в сутки, мл/сутки |
20,6 ± 6,0 |
20,2 ± 5,2 |
7,8 ± 4,5 |
Диурез в 1 минуту, мл/мин. |
0,015 ± 0,004 |
0,014 ± 0,004 |
0,005 ± 0,003 |
Мочевина крови, ммоль/л |
4,4 ± 0,5 |
5,4 ± 0,5 |
5,0 ± 0,6 |
Мочевина мочи, ммоль/л |
239 ± 76 |
255 ± 62 |
414 ± 113 |
Креатинин крови, ммоль/л |
0,032 ± 0,002 |
0,028 ± 0,002 |
0,029 ± 0,006 |
Креатинин мочи, ммоль/л |
3,9 ± 2,2 |
2,7 ± 1,0 |
6,2 ± 2,1 |
Натрий плазмы, ммоль/л |
141,6 ± 2,3 |
139,6 ± 1,6 |
140,2 ± 0,9 |
Натрий мочи, ммоль/л |
70 ± 21 |
123 ± 34 |
114 ± 32 |
Калий плазмы, ммоль/л |
4,6 ± 0,4 |
4,1 ± 0,2 |
5,6 ± 0,5 2 |
Калий мочи,ммоль/л |
48 ± 4 |
56 ± 13 |
99 ± 8 1 |
Экскреция калия, ммоль/сутки |
1,0 ± 0, 2 |
1,1 ± 0,3 |
0,8 ± 0,2 |
Осмолярность мочи, мосм/л |
439 ± 63 |
237 ± 551 |
427 ± 19 |
Клиренс креати-нина, мл/мин./кг |
4,1 ± 0,6 |
4,6 ± 0,7 |
4,1 ± 0,5 |
EFNa, % |
1,0 ± 0,3 |
1,1 ± 0,3 |
0,6 ± 0,2 |
Примечание: 1 - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с данными группы 1 (контрольная)
2 - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с данными группы 2
Оказалось, что после 4-дневого введения 0,06 % раствора ГН суточный и минутный диурез у животных 3 группы был заметно меньше, чем в 1 и 2 группах. Такую реакцию водовыделительной функции почек под действием ГН в предыдущих работах мы объясняли увеличением реабсорбции осмотически свободной воды, повышением активности канальцевой функции собирательных трубочек и поворотного сегмента петли Генле. В 3 группе животные меньше потребляли воду, поилки в обменных клетках оставались полными. Большинство биохимических показателей, характеризующих функцию почки, в 3 группе достоверно не изменялись, определяли лишь некоторый рост концентрации креатинина, мочевины и натрия в моче, что, возможно, связано с низким диурезом. В то же время мы получили достоверное возрастание концентрации калия в крови, достигающей верхней границы нормы, и концентрации калия в моче. Тенденция к гиперкалиемии связана с уменьшением суточной экскреции калия с мочой, которая в 1 группе составляла 1,01 ммоль/сутки, а в 3 группе уменьшилась до 0,79 ммоль/сутки. В то же время у ряда животных 3 группы отмечалось возрастание реабсорбции натрия (уменьшение EFNa c 1,0 до 0,6 %). У крыс 2 группы наблюдали достоверное уменьшение осмолярности мочи, несмотря на то, что концентрация натрия в моче несколько возрастала по сравнению с данными в контрольной группе.
Анализ данных биохимических исследований и функциональных способностей почек крыс позволяет заключить, что в/б введение 0,02 % или 0,06 % раствора ГН в течение 4 дней не оказывало какого-либо негативного воздействия на функцию почек. Все основные показатели, характеризующие функцию клубочков и почечных канальцев оставались в пределах нормы. Отмеченные изменения в реабосорбции воды и выведении катионов у крыс 3 группы, по всей видимости, связаны с активизацией функции собирательных канальцев и поворотного отдела петли Генле.
Заключение.
Полученные нами данные дают основания полагать, что в механизме противоишемического действия ГН существенную роль играет неспецифический компонент, сходный с таковым для других противоишемических препаратов с мембранотропным действием. Введение ГН вызывает изменения клеточного метаболизма в ткани почек подобные изменениям, развивающимся при ишемии этого органа, а именно: активация процессов ПОЛ и развитие энергодефицитного состояния, - но выраженным в значительно меньшей степени. Пусковым моментом реализации механизма действия ГН является, по-видимому, увеличение содержания кислородных радикалов во внутренней среде организма, что должно вести к активизации свободнорадикальных процессов. ГН и реакционные метаболиты, образующиеся в результате его монооксигеназной активности, способны ковалентно модифицировать биомакромолекулы, в том числе и фосфолипиды клеточных мембран [8,11]. Следствием этого могут быть определенные сдвиги в реакциях метаболизма и барьерных свойствах клеточных мембран, приводящие к изменению параметров внутриклеточной среды. В условиях сохраненного кровотока и возможностей системной регуляции метаболизма происходящие процессы не приводят к повреждению клеток, а активируют компенасаторно-приспособительные реакции, направленные на восстановление клеточного гомеостаза и приводящие к усилению энергопродукции, реализуют эффект стабилизации клеточных мембран и оптимизируют работу ферментных систем клеток. Все это и создает основу повышенной толерантности почки к ишемическому воздействию.
Таким образом, механизм противоишемического действия ГН может заключаться в том, что после его парентерального введения возникают условия, подобные предварительной имитации состояния ишемии, которые индуцируют заблаговременное включение защитных приспособительных реакций.
В наибольшей степени этот эффект реализуется при введении 0,06 % раствора ГН, однако, в меньшей степени аналогичные изменения мы отмечали и при использовании ГН в концентрации 0,02 %.
Список литературы
Арчаков А.И., Карузина И.И. Модификация макромолекул в реакциях окисления низкомолекулярных чужеродных соединений, как основа развития патологических состояний. // Тез. докл. науч. конф.: Эфферентные методы в медицине. - Анапа. - 1992. - С.5-6.
Бабаева Н.И., Липицкая И.Я., Творогова М.Г. и др. Диагностическое значение исследования активности N-ацетил-b-D-глюкозаминидазы в моче (обзор литературы). // Лабораторное дело 1. - Москва, «Медицина» - 1991. - С.9-16.
Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови. // Лабораторное дело. - 1989. - № 3. - С. 33-35.
Кирпатовский В.И., Онищенко Н.А., Козырева Т.А., Блюмкин В.И. Сравнительная оценка эффективности препаратов различных фармакологических групп, используемых для фармакологической защиты почек от ишемического повреждения. // Вестник Академии медицинских наук СССР. - 1981. - № 10. - С. 48-52.
Кирпатовский В.И., Онищенко Н.А., Петросова В.Н., Козырева Т.А. Фармакологическая защита почек от ишемического повреждения. О механизме реализации противоишемической защиты донорских почек препаратами различных фармакологических групп. // Вестник Академии медицинских наук СССР. - 1982. - № 1. - С. 73-78.
Лавренова Т.П. Определение активности ферментов мочи при поражениях почек. // Лабораторное дело. - № 7. - 1986. - С.430-432.
Меерсон Ф.З. Антиоксидантные факторы организма как система естественной профилактики стрессорных и гипоксических повреждений. В кн.: Адаптация, стресс, профилактика. - М., «Наука». - 1981. - С. 226-257.
Панасенко О.М. Механизм взаимодействия электрохимически полученного гипохлорита натрия с липидами мембран и липопротеинов. // Труды Всероссийской конференции.: Сорбционные, электрохимические и гравитационные методы в современной медицине. - Москва. - 26-28 октября 1999 г. - С. 89-90.
Фоменко Г.В., Липицкая И.Я., Арабидзе Г.Г. и др. Диагностическое значение энзимурии (обзор литературы). // Клиническая лабораторная диагностика. - 1994. - № 4. - С. 3-7.
Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Кирпатовский В.И. Адаптация донорских органов к воздействию повреждающих факторов консервации. В кн.: Фармакологическая защита трансплантата. - М., «Медицина». - 1983. - С. 98-101.
Яковенко И.Н., Стефанов А.Ф., Формазюк В.Е., Сергиенко В.И. Исследование взаимодействия гипохлорит-аниона с одноламеллярными фосфатидилхолиновыми липосомами методом УФ-абсорбционной спектроскопии. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2000. - № 3.- С. 287-290.